TIANSeq ਸਿੰਗਲ-ਇੰਡੈਕਸ ਅਡਾਪਟਰ (Illumina)

ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ, ਉੱਚ-ਥ੍ਰੂਪੁਟ ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਟੈਕਨਾਲੌਜੀ ਮੁੱਖ ਤੌਰ ਤੇ ਅਗਲੀ ਪੀੜ੍ਹੀ ਦੀ ਸੀਕਵੈਂਸਿੰਗ ਤਕਨਾਲੋਜੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ. ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਗਲੀ ਪੀੜ੍ਹੀ ਦੀ ਲੜੀਵਾਰ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਦੀ ਪੜ੍ਹਨ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਸੀਮਤ ਹੈ, ਸਾਨੂੰ ਪੂਰੀ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਛੋਟੇ ਟੁਕੜੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਤੋੜਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ. ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਤਰਤੀਬਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੀਆਂ ਜ਼ਰੂਰਤਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਅਸੀਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਿੰਗਲ-ਐਂਡ ਕ੍ਰਮਬੱਧਤਾ ਜਾਂ ਡਬਲ-ਐਂਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਦੇ ਹਾਂ. ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ ਅਗਲੀ ਪੀੜ੍ਹੀ ਦੀ ਲੜੀਵਾਰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਆਮ ਤੌਰ ਤੇ 200-800 ਬੀਪੀ ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਵੰਡੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ.

a) ਡੀਐਨਏ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਿੱਚ ਮਾੜੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਹੁੰਦੇ ਹਨ. ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਉੱਚ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਡੀਐਨਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ.

ਅ) ਡੀਐਨਏ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪੀਸੀਆਰ-ਰਹਿਤ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਡੀਐਨਏ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਾਕਾਫੀ ਹੈ. ਜਦੋਂ ਖੰਡਿਤ ਡੀਐਨਏ ਦਾ ਇਨਪੁਟ 50 ਐਨਜੀ ਤੋਂ ਵੱਧ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਿਰਮਾਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਪੀਸੀਆਰ-ਰਹਿਤ ਵਰਕਫਲੋ ਚੋਣਵੇਂ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਜੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਸਿੱਧਾ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕਰਨ ਲਈ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਡੀਐਨਏ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨੂੰ ਅਡੈਪਟਰ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ.

c) ਆਰਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਗਲਤ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਡੀਐਨਏ ਕੁਆਂਟਿਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜੀਐਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਆਰ ਐਨ ਏ ਗੰਦਗੀ ਮੌਜੂਦ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਿਰਮਾਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਗਲਤ ਡੀਐਨਏ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਨਾਕਾਫ਼ੀ ਡੀਐਨਏ ਲੋਡਿੰਗ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ. ਆਰ ਐਨ ਏ ਨੂੰ ਆਰਨੇਸ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕਰਕੇ ਹਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ.

ਏ -1

a) ਛੋਟੇ ਟੁਕੜੇ (60 bp-120 bp) ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਛੋਟੇ ਟੁਕੜੇ ਆਮ ਤੌਰ ਤੇ ਅਡੈਪਟਰ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਅਡੈਪਟਰ ਟੁਕੜੇ ਜਾਂ ਡਾਈਮਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ. ਏਜੰਕੋਰਟ ਏਐਮਪਯੂਰ ਐਕਸਪੀ ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਨਾਲ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਇਨ੍ਹਾਂ ਅਡੈਪਟਰ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ removeੰਗ ਨਾਲ ਹਟਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾ ਸਕਦੀ ਹੈ.

b) ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸਤਾਰ ਦੇ ਬਾਅਦ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਵੱਡੇ ਟੁਕੜੇ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਅਡੈਪਟਰ ਦੇ ਲਾਇਗੇਟ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਆਕਾਰ 120 ਬੀਪੀ ਤੱਕ ਵਧੇਗਾ. ਜੇ ਅਡੈਪਟਰ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਡੀਐਨਏ ਦਾ ਟੁਕੜਾ 120 ਬੀਪੀ ਤੋਂ ਵੱਧ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸਤਾਰ ਦੇ ਅਸਧਾਰਨ ਟੁਕੜੇ ਵਧਾਉਣ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਪੀਸੀਆਰ ਸਾਈਕਲਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਘਟਾਉਣ ਨਾਲ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ.

ਅ) ਅਡੈਪਟਰ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦਾ ਅਸਧਾਰਨ ਆਕਾਰ ਇਸ ਕਿੱਟ ਵਿੱਚ ਅਡੈਪਟਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 60 ਬੀਪੀ ਹੈ. ਜਦੋਂ ਟੁਕੜੇ ਦੇ ਦੋ ਸਿਰੇ ਅਡੈਪਟਰਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਲੰਬਾਈ ਸਿਰਫ 120 ਬੀਪੀ ਤੱਕ ਵਧੇਗੀ. ਜਦੋਂ ਇਸ ਕਿੱਟ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਕਿਸੇ ਅਡੈਪਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਸੰਬੰਧਤ ਜਾਣਕਾਰੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਸਪਲਾਇਰ ਨਾਲ ਸੰਪਰਕ ਕਰੋ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਡੈਪਟਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ. ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਇਹ ਸੁਨਿਸ਼ਚਿਤ ਕਰੋ ਕਿ ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਰਕਫਲੋ ਅਤੇ ਕਾਰਜ ਦਸਤਾਵੇਜ਼ ਵਿੱਚ ਦੱਸੇ ਗਏ ਕਦਮਾਂ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਦੇ ਹਨ.

d) ਅਡਾਪਟਰ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਸਾਧਾਰਣ ਡੀਐਨਏ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਆਕਾਰ ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਦਾ ਕਾਰਨ ਡੀਐਨਏ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਗਲਤ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਥਿਤੀਆਂ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਵੱਖਰੇ ਡੀਐਨਏ ਇਨਪੁਟ ਲਈ ਵੱਖਰੇ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਸਮੇਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ. ਜੇ ਡੀਐਨਏ ਇਨਪੁਟ 10 ਐਨਜੀ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ minਪਟੀਮਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਮੇਂ ਵਜੋਂ 12 ਮਿੰਟ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਮੇਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਅਤੇ ਇਸ ਸਮੇਂ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਖੰਡ ਦਾ ਆਕਾਰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ ਤੇ 300-500 ਬੀਪੀ ਦੀ ਸੀਮਾ ਵਿੱਚ ਹੁੰਦਾ ਹੈ. ਲੋੜੀਂਦੇ ਆਕਾਰ ਦੇ ਨਾਲ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਉਪਭੋਗਤਾ ਆਪਣੀਆਂ ਜ਼ਰੂਰਤਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ 2-4 ਮਿੰਟ ਲਈ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਵਧਾ ਜਾਂ ਘਟਾ ਸਕਦੇ ਹਨ.

ਏ -2

ਏ) ਫਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਸਮਾਂ ਅਨੁਕੂਲ ਨਹੀਂ ਹੈ ਜੇ ਖੰਡਿਤ ਡੀਐਨਏ ਬਹੁਤ ਛੋਟਾ ਜਾਂ ਬਹੁਤ ਵੱਡਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਮਾਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਨਿਰਦੇਸ਼ ਵਿੱਚ ਮੁਹੱਈਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਸਮਾਂ ਚੋਣ ਲਈ ਦਿਸ਼ਾ ਨਿਰਦੇਸ਼ ਵੇਖੋ, ਅਤੇ ਇਸ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤੋ, ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਇੱਕ ਸਥਾਪਤ ਕਰੋ ਖੰਡਨ ਸਮੇਂ ਤੇ ਵਧੇਰੇ ਸਹੀ ਵਿਵਸਥਾ ਕਰਨ ਲਈ 3 ਮਿੰਟ ਨੂੰ ਲੰਮਾ ਜਾਂ ਛੋਟਾ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ.

ਏ -3

ਟੁਕੜੇ ਦੇ ਇਲਾਜ ਦੇ ਬਾਅਦ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਅਸਾਧਾਰਣ ਆਕਾਰ ਵੰਡ

ਏ) ਫਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਰੀਐਜੈਂਟ ਦੀ ਗਲਤ ਪਿਘਲਣ ਦੀ ਵਿਧੀ, ਜਾਂ ਪਿਘਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਰੀਐਜੈਂਟ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਇਆ ਨਹੀਂ ਜਾਂਦਾ. ਬਰਫ਼ ਤੇ 5 × ਫਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਮਿਕਸ ਰੀਐਜੈਂਟ ਨੂੰ ਪਿਘਲਾਉ. ਇੱਕ ਵਾਰ ਪਿਘਲ ਜਾਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਟਿ .ਬ ਦੇ ਹੇਠਲੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਨਰਮੀ ਨਾਲ ਹਿਲਾ ਕੇ ਰੀਐਜੈਂਟ ਨੂੰ ਬਰਾਬਰ ਮਿਲਾਉ. ਰੀਐਜੈਂਟ ਦਾ ਚੱਕਰ ਨਾ ਲਾਓ!

ਅ) ਡੀਐਨਏ ਇਨਪੁਟ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਈਡੀਟੀਏ ਜਾਂ ਹੋਰ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਡੀਐਨਏ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਨਮਕ ਆਇਨਾਂ ਅਤੇ ਚੇਲੇਟਿੰਗ ਏਜੰਟਾਂ ਦੀ ਕਮੀ ਖਾਸ ਤੌਰ ਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀ ਸਫਲਤਾ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਹੈ. ਜੇ ਡੀਐਨਏ 1 × ਟੀਈ ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਟੁਕੜੇ ਕਰਨ ਲਈ ਨਿਰਦੇਸ਼ ਵਿੱਚ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ. ਜੇ ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਈਡੀਟੀਏ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਨਿਸ਼ਚਿਤ ਹੈ, ਤਾਂ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਅਤੇ ਇਸ ਨੂੰ ਅਗਲੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਲਈ ਡੀਯੋਨਾਈਜ਼ਡ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ.

c) ਗਲਤ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਡੀਐਨਏ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਡੀਐਨਏ ਦਾ ਆਕਾਰ ਡੀਐਨਏ ਇਨਪੁਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਾਲ ਨੇੜਿਓਂ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ. ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਸਹੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿubਬਿਟ, ਪਿਕੋਗ੍ਰੀਨ ਅਤੇ ਹੋਰ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਿਆਂ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਸਹੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ.

 d) ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਹਦਾਇਤਾਂ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਨਹੀਂ ਕਰਦੀ ਖੰਡਿਤ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਬਰਫ ਤੇ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ. ਸਰਬੋਤਮ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਹਿੱਸਿਆਂ ਨੂੰ ਬਰਫ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਠੰਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ. ਤਿਆਰੀ ਪੂਰੀ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਰਲਾਉਣ ਲਈ ਫਲਿੱਕ ਕਰੋ ਜਾਂ ਪਾਈਪੈਟ ਕਰੋ. ਘੁੰਮਣ ਨਾ ਕਰੋ!

1. ਗਲਤ ਮਿਲਾਉਣ ਦਾ (ੰਗ (ਵੌਰਟੇਕਸ, ਹਿੰਸਕ oscਸਿਲੇਸ਼ਨ, ਆਦਿ) ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਅਸਧਾਰਨ ਵੰਡ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣੇਗਾ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ), ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰੇਗਾ. ਇਸ ਲਈ, ਫਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਮਿਕਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਹੱਲ ਤਿਆਰ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਲਈ ਉੱਪਰ ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ ਨਰਮੀ ਨਾਲ ਪਾਈਪ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਉਂਗਲੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਝਟਕਾਉਣ ਅਤੇ ਸਮਾਨ ਰੂਪ ਨਾਲ ਮਿਲਾਉਣ ਲਈ ਕਰੋ. ਧਿਆਨ ਰੱਖੋ ਕਿ ਘੁੰਮਣ ਨਾਲ ਨਾ ਰਲੋ.

2. ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ ਉੱਚ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਵਾਲੇ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ

DNA ਚੰਗੀ ਡੀਐਨਏ ਇਕਸਾਰਤਾ: ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਬੈਂਡ ਬਿਨਾਂ ਪੂਛ ਦੇ 30 ਕੇਬੀ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ

■ OD260/230:> 1.5

■ ਓਡੀ 260/280: 1.7-1.9

3. ਡੀਐਨਏ ਇਨਪੁਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਸਹੀ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ ਨੈਨੋਡ੍ਰੌਪ ਦੀ ਬਜਾਏ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿubਬਿਟ ਅਤੇ ਪਿਕੋ ਗ੍ਰੀਨ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ.

4. ਡੀਐਨਏ ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਈਡੀਟੀਏ ਦੀ ਸਮਗਰੀ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਈਡੀਟੀਏ ਦਾ ਖੰਡਨ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਤੇ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ. ਜੇ ਈਡੀਟੀਏ ਦੀ ਸਮਗਰੀ ਉੱਚੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਡੀਐਨਏ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੂੰ ਅਗਲੇਰੀ ਜਾਂਚ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਕਰਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੈ.

5. ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਹੱਲ ਬਰਫ ਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਖੰਡਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਸਮੇਂ (ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਵਧਾਉਣ ਵਾਲੇ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ) ਪ੍ਰਤੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੀ ਹੈ. ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਮੇਂ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਬਰਫ਼ ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਤਿਆਰ ਕਰੋ.

6. ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਸਮਾਂ ਸਹੀ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਪੜਾਅ ਦਾ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਮਾਂ ਸਿੱਧਾ ਖੰਡ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਆਕਾਰ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰੇਗਾ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਆਕਾਰ ਦੀ ਵੰਡ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰੇਗਾ.

1. ਇਸ ਕਿੱਟ ਤੇ ਕਿਸ ਕਿਸਮ ਦਾ ਨਮੂਨਾ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ?

ਇਸ ਕਿੱਟ ਦੇ ਲਾਗੂ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਕਿਸਮ ਚੰਗੀ ਆਰਐਨਏ ਅਖੰਡਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਕੁੱਲ ਆਰਐਨਏ ਜਾਂ ਸ਼ੁੱਧ ਐਮਆਰਐਨਏ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ. ਜੇ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ ਕੁੱਲ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਪਹਿਲਾਂ ਆਰਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਆਰਆਰਐਨਏ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੀ ਕਿੱਟ (ਕੈਟ#4992363/4992364/4992391) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ.

2. ਕੀ FFPE ਨਮੂਨੇ ਇਸ ਕਿੱਟ ਨਾਲ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ?

ਐੱਫਐਫਪੀਈ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਐਮਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਕੁਝ ਹੱਦ ਤਕ ਨੀਵਾਂ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ, ਜਿਸਦੀ ਤੁਲਨਾਤਮਕ ਮਾੜੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਹੈ. ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ ਇਸ ਕਿੱਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਖੰਡ ਦੇ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ (ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਸਮਾਂ ਛੋਟਾ ਕਰੋ ਜਾਂ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਨਾ ਕਰੋ).

3. ਉਤਪਾਦ ਮੈਨੁਅਲ ਵਿੱਚ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਆਕਾਰ ਦੀ ਚੋਣ ਦੇ ਪੜਾਅ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਸੰਮਿਲਤ ਹਿੱਸੇ ਵਿੱਚ ਮਾਮੂਲੀ ਭਟਕਣ ਦਾ ਕੀ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ?

ਆਕਾਰ ਦੀ ਚੋਣ ਇਸ ਉਤਪਾਦ ਮੈਨੁਅਲ ਦੇ ਆਕਾਰ ਚੋਣ ਪੜਾਅ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਜਾਏਗੀ. ਜੇ ਕੋਈ ਭਟਕਣਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਕਾਰਨ ਇਹ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਜਾਂ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਏ ਨਹੀਂ ਜਾਂਦੇ, ਪਾਈਪੈਟ ਸਹੀ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ ਜਾਂ ਤਰਲ ਟਿਪ ਵਿੱਚ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ. ਪ੍ਰਯੋਗ ਲਈ ਘੱਟ ਸੋਖਣ ਦੇ ਨਾਲ ਸੁਝਾਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ.

4. ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਿਰਮਾਣ ਵਿੱਚ ਅਡਾਪਟਰਾਂ ਦੀ ਚੋਣ

ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਿਰਮਾਣ ਕਿੱਟ ਵਿੱਚ ਅਡੈਪਟਰ ਰੀਐਜੈਂਟ ਸ਼ਾਮਲ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸ ਕਿੱਟ ਨੂੰ TIANSeq ਸਿੰਗਲ-ਇੰਡੈਕਸ ਅਡਾਪਟਰ (ਇਲੁਮਿਨਾ) (4992641/4992642/4992378) ਦੇ ਨਾਲ ਵਰਤਣ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ.

5. ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦਾ ਕਿC.ਸੀ

ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਖੋਜ: ਕਿubਬਿਟ ਅਤੇ ਕਿqਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੇ ਪੁੰਜ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਮੋਲਰ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ. ਓਪਰੇਸ਼ਨ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਉਤਪਾਦ ਮੈਨੁਅਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੈ. ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਨਜੀਐਸ ਦੀ ਤਰਤੀਬ ਦੀਆਂ ਜ਼ਰੂਰਤਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰੇਗੀ. ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਡਿਸਟ੍ਰੀਬਿ rangeਸ਼ਨ ਰੇਂਜ ਦੀ ਖੋਜ: ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਡਿਸਟ੍ਰੀਬਿ rangeਸ਼ਨ ਰੇਂਜ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ Agilent 2100 Bioanalyzer ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ.

6. ਵਿਸਤਾਰ ਚੱਕਰ ਨੰਬਰ ਦੀ ਚੋਣ

ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਪੀਸੀਆਰ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ 6-12 ਹੈ, ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਇਨਪੁਟ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਚੁਣੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ. ਉੱਚ-ਉਪਜ ਵਾਲੀਆਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਵਿੱਚ, ਆਮਤੌਰ ਤੇ ਵਧੇਰੇ ਵਿਸਤਾਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਡਿਗਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਐਗਿਲੈਂਟ 2100 ਬਾਇਓਨਾਲਾਈਜ਼ਰ ਦੀ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਟੀਚੇ ਦੀ ਸੀਮਾ ਦੇ ਸਿਖਰ ਦੇ ਬਾਅਦ ਥੋੜ੍ਹੀ ਵੱਡੀ ਚੋਟੀ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਾਂ ਕਿubਬਿਟ ਦੀ ਖੋਜ ਕੀਤੀ ਗਈ ਇਕਾਗਰਤਾ qPCR ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ. ਹਲਕਾ ਜਿਹਾ ਵਿਸਤਾਰ ਇੱਕ ਸਧਾਰਨ ਵਰਤਾਰਾ ਹੈ, ਜੋ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਦੀ ਤਰਤੀਬ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ.

7. ਐਜੀਲੈਂਟ 2100 ਬਾਇਓਨਾਲਾਈਜ਼ਰ ਦੀ ਖੋਜ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਵਿੱਚ ਸਪਾਈਕਸ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ

ਐਜੀਲੈਂਟ 2100 ਬਾਇਓਨਾਲਾਈਜ਼ਰ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਸਪਾਈਕਸ ਦੀ ਦਿੱਖ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਅਸਮਾਨ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ ਕੁਝ ਆਕਾਰ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਟੁਕੜੇ ਹੋਣਗੇ, ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਦੇ ਬਾਅਦ ਇਹ ਵਧੇਰੇ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੋ ਜਾਵੇਗਾ. ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਆਕਾਰ ਦੀ ਚੋਣ ਨਾ ਕਰਨ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਭਾਵ 15 ਮਿੰਟ ਇਨਕਿatedਬੇਟਡ ਲਈ ਫ੍ਰੇਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਸ਼ਰਤ ਨੂੰ 94 ° C ਤੇ ਸੈਟ ਕਰੋ, ਜਿੱਥੇ ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਵੰਡ ਛੋਟੀ ਅਤੇ ਸੰਘਣੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਕਸਾਰਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ.