ਕੁਆਂਟਸਕ੍ਰਿਪਟ ਆਰਟੀ ਕਿੱਟ

ਏ -1 ਆਰਐਨਏ ਡਿਗਰੇਡ ਹੈ

- ਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ ਗੰਦਗੀ ਦੇ ਉੱਚ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰੋ. ਉਹ ਸਮਗਰੀ ਜਿਸ ਤੋਂ ਆਰ ਐਨ ਏ ਕੱedਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਆਰ ਐਨ ਏ ਦੇ ਨਿਘਾਰ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਜਿੰਨਾ ਸੰਭਵ ਹੋ ਸਕੇ ਤਾਜ਼ਾ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ. ਆਰਟੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਖਰਾਬ ਜੈੱਲ 'ਤੇ ਆਰਐਨਏ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰੋ. ਆਰ ਐਨ ਏ ਕੱ extraਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸਨੂੰ 100% ਫੋਰਮਾਈਡ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ. ਜੇ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਹੀਟਿੰਗ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ <45 ° C ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ pH 8.0 ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਨਹੀਂ ਤਾਂ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਸਾਰੇ ਬੰਨ੍ਹੇ ਹੋਏ RNase ਨੂੰ ਛੱਡ ਦੇਵੇਗਾ. ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨੂੰ solutions 0.8 mM DTT ਵਾਲੇ ਸਮਾਧਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ.

ਏ -2 ਆਰਐਨਏ ਵਿੱਚ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮਾਂ ਦੇ ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਵਿੱਚ ਐਸਡੀਐਸ, ਈਡੀਟੀਏ, ​​ਗਲਾਈਸਰੋਲ, ਸੋਡੀਅਮ ਪਾਈਰੋਫੋਸਫੇਟ, ਸਪਰਮਿਡੀਨ, ਫੋਰਮਾਈਡ, ਗੁਆਨੀਡੀਨ ਨਮਕ, ਆਦਿ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਨਿਯੰਤਰਣ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾਓ, ਅਤੇ ਉਪਜ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਆਰਐਨਏ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨਾਲ ਕਰੋ ਇਹ ਜਾਂਚਣ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਕੋਈ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਹੈ. ਰੋਕਥਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲਿਆਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ 70% (v/v) ਐਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਆਰਐਨਏ ਵਰਖਾ ਨੂੰ ਧੋਵੋ.

ਏ -3 ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਕਿਨਾਰੇ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਦੀ ਨਾਕਾਫ਼ੀ ਐਨਲਿੰਗ

- ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ ਕਿ ਅਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਲਈ ੁਕਵਾਂ ਹੈ. ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਹੈਕਸੇਮਰਸ ਲਈ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ 25 ° C' ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਰੱਖਣ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ. ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ (ਜੀਐਸਪੀ) ਲਈ, ਹੋਰ ਜੀਐਸਪੀ ਅਜ਼ਮਾਓ, ਜਾਂ ਓਲੀਗੋ (ਡੀਟੀ) ਜਾਂ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਹੈਕਸੇਮਰ ਤੇ ਜਾਓ.

A-4 ਆਰਐਨਏ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਦੀ ਛੋਟੀ ਮਾਤਰਾ

- ਆਰ ਐਨ ਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਧਾਓ. 50 ਐਨਜੀ ਤੋਂ ਘੱਟ ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, 0.1 μg ਤੋਂ 0.5 μg acetyl BSA ਨੂੰ ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ

ਏ -5 ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਕ੍ਰਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤੇ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ.

- ਹੋਰ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰੋ.

ਏ -6 ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਅਸਫਲ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ

-ਦੋ-ਪਗ ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ, ਪੀਸੀਆਰ ਪਗ ਵਿੱਚ ਸੀਡੀਐਨਏ ਟੈਮਪਲੇਟ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਵਾਲੀਅਮ ਦੇ 1/5 ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦਾ.

ਏ -1 ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਦੀ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਨੀਲਿੰਗ

-ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਦੇ 3'-ਸਿਰੇ ਵਿੱਚ 2-3 ਡੀਜੀ ਜਾਂ ਡੀਸੀ ਨਹੀਂ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ. ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਜਾਂ ਓਲੀਗੋ (ਡੀਟੀ) ਦੀ ਬਜਾਏ ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਵਿੱਚ ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ. ਪਹਿਲੇ ਕੁਝ ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਘੱਟ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ. ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਤਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ.

ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਦਾ ਏ -2 ਮਾੜਾ ਡਿਜ਼ਾਈਨ

Amp ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਲਈ ਉਹੀ ਸਿਧਾਂਤਾਂ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰੋ.

ਏ -3 ਆਰਐਨਏ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਦੂਸ਼ਿਤ ਹੈ

-ਪੀਸੀਆਰ-ਗ੍ਰੇਡ ਡੀਨੇਸ I ਦੇ ਨਾਲ ਆਰਐਨਏ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕਰੋ। ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀਕਰਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਥਾਪਤ ਕਰੋ.

ਏ -4 ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਈਮਰ ਦਾ ਗਠਨ

- 3 'ਦੇ ਅੰਤ' ਤੇ ਪੂਰਕ ਲੜੀ ਦੇ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰੋ.

ਏ -5 ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ²⁺ ਧਿਆਨ ਟਿਕਾਉਣਾ

- ptਪਟੀਮਾਈਜ਼ ਐਮ.ਜੀ²⁺ ਹਰੇਕ ਟੈਮਪਲੇਟ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੁਮੇਲ ਲਈ ਇਕਾਗਰਤਾ

ਏ -6 ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਦੂਸ਼ਿਤ

-ਐਰੋਸੋਲ-ਰੋਧਕ ਸੁਝਾਅ ਅਤੇ ਯੂਡੀਜੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ.

ਏ -1 ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਸਮਗਰੀ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ

- ਰਵਾਇਤੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਘਟਾਓ.

ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਵਿੱਚ ਏ -2 ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਾਤਰਾ

- ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਇਨਪੁਟ ਘਟਾਓ.

ਏ -3 ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਚੱਕਰ

ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਚੱਕਰ ਨੰਬਰ ਨੂੰ ਘਟਾਓ.

ਏ -4 ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ

Non ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਅਤੇ ਵਿਸਥਾਰ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਾਓ.

ਏ -5 ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਡੀਨੇਜ਼ ਡਿਗ੍ਰੇਡੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਉਤਪੰਨ ਹੋਏ ਓਲੀਗੋਨੁਕਲੀਓਟਾਈਡ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦਾ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਿਸਤਾਰ-ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਉੱਚ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਕੱੋ.

ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਉਲਟਾਉਣਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਵਜੋਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਡ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ ਹੈ. ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਜਾਂ ਤਾਂ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ ਅਤੇ ਜੀਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਚੁਣੋ. ਉਪਰੋਕਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਛੋਟੇ ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ ਸੈੱਲ ਐਮਆਰਐਨਏ ਲਈ ਵਾਲਾਂ ਦੇ pਾਂਚੇ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ.

ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ: ਹੇਅਰਪਿਨ structureਾਂਚੇ ਦੇ ਨਾਲ ਲੰਬੇ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਨਾਲ ਨਾਲ ਹਰ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਆਰਐਨਏ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਆਰਆਰਐਨਏ, ਐਮਆਰਐਨਏ, ਟੀਆਰਐਨਏ, ਆਦਿ ਲਈ ਉਚਿਤ ਹਨ ਉਹ ਮੁੱਖ ਤੌਰ ਤੇ ਸਿੰਗਲ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ.

ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ: ਪੌਲੀਏ ਟੇਲਿੰਗ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਲਈ ਉਚਿਤ (ਪ੍ਰੋਕਾਰਿਓਟਿਕ ਆਰਐਨਏ, ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ ਆਰਆਰਐਨਏ ਅਤੇ ਟੀਆਰਐਨਏ ਵਿੱਚ ਪੌਲੀਏ ਪੂਛ ਨਹੀਂ ਹੈ). ਕਿਉਂਕਿ ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ ਪੌਲੀਏ ਪੂਛ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਉੱਚੀ ਹੋਣੀ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ ਥੋੜ੍ਹੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਗਿਰਾਵਟ ਪੂਰੀ ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗੀ.

ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ: ਟੈਂਪਲੇਟ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਪੂਰਕ, ਉਨ੍ਹਾਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਲਈ suitableੁਕਵਾਂ ਜਿੱਥੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ.

ਦੋ ਤਰੀਕੇ ਹਨ:

1. ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਵਿਧੀ: ਸਿਧਾਂਤ ਵਿੱਚ, ਸੀਡੀਐਨਏ ਵੱਖ ਵੱਖ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਟੁਕੜੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਇਸ ਲਈ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਸਮੀਅਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ. ਜੇ ਆਰ ਐਨ ਏ ਦੀ ਬਹੁਤਾਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਕੋਈ ਵੀ ਉਤਪਾਦ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਵਿਖਾਈ ਦੇਵੇਗਾ, ਪਰ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਇਹ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ ਕੋਈ ਉਤਪਾਦ ਵਧਾਇਆ ਨਹੀਂ ਜਾਵੇਗਾ. ਆਮ ਤੌਰ ਤੇ, ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ. ਜੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੀ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਗਾਰੰਟੀ ਦਿੱਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ (ਕੁਝ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਜੇ ਟੀਚੇ ਦਾ ਜੀਨ ਟੁਕੜਾ ਬਹੁਤ ਲੰਬਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਅਪਵਾਦ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ).

2. ਜੇ ਇਸ ਨਮੂਨੇ ਦੁਆਰਾ ਕੋਈ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਜੀਨ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸ ਜੀਨ ਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੇ ਵਿਸਤਾਰ ਦਾ ਇਹ ਜ਼ਰੂਰੀ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ. ਕਿਉਂਕਿ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਵਿੱਚ ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਭਰਪੂਰਤਾ ਹੈ, ਇਸ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਅਸਾਨ ਹੈ. ਜੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਵੱਖ -ਵੱਖ ਕਾਰਨਾਂ ਕਰਕੇ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ ਤੇ ਨੀਵਾਂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਸੰਭਾਵਨਾ ਦੇ ਨਜ਼ਰੀਏ ਤੋਂ, ਘੱਟ ਬਹੁਤਾਤ ਵਾਲੇ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਪੀਸੀਆਰ ਨਤੀਜੇ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਹੋਣਗੇ. ਹਾਲਾਂਕਿ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਅਜੇ ਵੀ ਭਰਪੂਰ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਹੈ, ਪਰ ਵਿਸਤਾਰ ਸ਼ਾਇਦ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਹੋਏਗਾ.

ਆਰ ਐਨ ਏ ਦਾ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ ਤੇ ਨਿਘਾਰ. ਆਰ ਐਨ ਏ ਦੀ ਅਖੰਡਤਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਓ

ਵੱਖੋ ਵੱਖਰੀਆਂ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਆਰਐਨਏ ਸਮਗਰੀ ਵੱਖੋ ਵੱਖਰੇ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਆਮ ਤੌਰ ਤੇ, ਕੱedੇ ਗਏ ਕੁੱਲ ਆਰਐਨਏ ਵਿੱਚ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਵਿੱਚ ਦੋ ਸਪਸ਼ਟ 28 ਐਸ ਅਤੇ 18 ਐਸ ਬੈਂਡ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਪਹਿਲੇ ਬੈਂਡ ਦੀ ਚਮਕ ਬਾਅਦ ਵਾਲੇ ਨਾਲੋਂ ਦੁੱਗਣੀ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ. 5 ਐਸ ਬੈਂਡ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਨੀਵਾਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਚਮਕ ਪਤਨ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤਕ ਹੈ. ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੇ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਵਿਸਤਾਰ ਦਾ ਇਹ ਮਤਲਬ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਆਰਐਨਏ ਨਾਲ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਉਦੋਂ ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਗਿਰਾਵਟ ਗੰਭੀਰ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ. ਓ.ਡੀ₂₆₀/ਓਡੀ₂₈₀ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ ਦੁਆਰਾ ਮਾਪੇ ਗਏ ਸ਼ੁੱਧ ਆਰਐਨਏ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ 1.9 ਅਤੇ 2.1 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ. ਆਰ ਐਨ ਏ ਵਿੱਚ ਥੋੜ੍ਹੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗੀ. ਜਿੰਨਾ ਚਿਰ ਮੁੱਲ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ, ਆਰਟੀ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਹੋਏਗਾ. ਆਰਟੀ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਚੀਜ਼ ਆਰਐਨਏ ਇਕਸਾਰਤਾ ਹੈ.

ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦਾ ਵਿਸਥਾਰ ਸਿਰਫ ਇਹ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਆਰਟੀ ਸਫਲ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਜ਼ਰੂਰੀ ਤੌਰ ਤੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਨਹੀਂ ਹੈ. ਕਿਉਂਕਿ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਆਮ ਤੌਰ ਤੇ ਆਕਾਰ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਅਤੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ ਉੱਚੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀਕਰਨ ਵਿੱਚ ਸਫਲ ਹੋਣਾ ਸੌਖਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ. ਹਾਲਾਂਕਿ, ਲਕਸ਼ ਜੀਨ ਦਾ ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਜੀਨ ਤੋਂ ਜੀਨ ਤੱਕ ਵੱਖਰਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ. ਸੀਡੀਐਨਏ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਨਿਰਣਾ ਸਿਰਫ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੁਆਰਾ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ, ਖ਼ਾਸਕਰ 2 ਕੇਬੀ ਤੋਂ ਵੱਧ ਦੇ ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਲਈ.

ਕੁਝ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਸੈਕੰਡਰੀ structuresਾਂਚੇ ਹਨ, ਜਾਂ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚ ਅਮੀਰ ਜੀਸੀ ਸਮਗਰੀ ਹੈ, ਜਾਂ ਘੱਟ ਬਹੁਤਾਤ ਦੇ ਨਾਲ ਕੀਮਤੀ ਹਨ. ਇਹਨਾਂ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਦੇ ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਉਚਿਤ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ. ਉੱਚ ਜੀਸੀ ਸਮਗਰੀ ਅਤੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਸੈਕੰਡਰੀ structureਾਂਚੇ ਵਾਲੇ ਆਰ ਐਨ ਏ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ, ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ ਤੇ, ਜਾਂ ਆਮ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਨਾਲ ਸੈਕੰਡਰੀ structureਾਂਚੇ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ. ਇਨ੍ਹਾਂ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ, ਕੁਆਂਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸਦਾ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਐਮ-ਐਮਐਲਵੀ ਸੀਰੀਜ਼ ਦੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਨਾਲੋਂ ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ ਤੇ ਬਿਹਤਰ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਵੱਖੋ ਵੱਖਰੇ ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਉਲਟਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਵਿੱਚ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੱਦ ਤਕ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਆਮ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਕਿੱਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, 20 μl ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਕੁੱਲ ਆਰਐਨਏ ਦੇ 1 μg ਨੂੰ ਸਿਰਫ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ reverseੰਗ ਨਾਲ ਉਲਟਾ ਸਕਦੀ ਹੈ. ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਕਿੱਟ ਦੀ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਆਰਟੀ ਸਮਰੱਥਾ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿਓ. ਜੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਜ਼ਿਆਦਾ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਉੱਚ ਬਹੁਤਾਤ ਦੇ ਨਾਲ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਪੱਖ ਵਿੱਚ ਰਹੇਗੀ. ਇਸ ਲਈ, ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਮਰੱਥਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਾ ਹੋਣਾ ਬਿਹਤਰ ਹੈ.

ਏ -1 ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ ਕਿ ਕੀ ਆਰਐਨਏ ਬੁਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਿਘਰਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਅਤੇ ਜੇ ਆਰਟੀ ਸਫਲ ਹੈ

ਆਮ ਤੌਰ ਤੇ, ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਵਿਸਤਾਰ ਦੀ ਅਸਫਲਤਾ ਦਾ ਕਾਰਨ ਅਕਸਰ ਗੰਭੀਰ ਆਰਐਨਏ ਨਿਘਾਰ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ. ਇਕ ਹੋਰ ਸੰਭਵ ਕਾਰਨ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਸਫਲਤਾ ਹੈ. ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸਿੰਗਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਨਿਰਣਾ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮਿਆਰ ਵਜੋਂ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ, ਪਰ ਇਹ ਨਿਰਣਾ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮਿਆਰ ਵਜੋਂ ਵਰਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਕਿ ਜੇ ਆਰਐਨਏ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੀ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ ਤਾਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸਫਲ ਹੈ ਜਾਂ ਨਹੀਂ. ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਨਿਰੰਤਰ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਨਿਰੰਤਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣਾ.

ਏ -2 ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ ਕਿ ਕੀ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਹਨ ਅਤੇ ਜੇ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਨਾਲ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਹੈ.

ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾ ਲਈ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਿੱਟਾਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਲੋੜੀਂਦੀ ਹੈ, ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ, ਆਰਐਨਏ ਇਨਪੁਟ ਨੂੰ 1 μg ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਮਾਪੋ. ਕਿਉਂਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਡ ਸੀਡੀਐਨਏ ਇੱਕ ਮਿਸ਼ਰਤ ਹੱਲ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਆਰ ਐਨ ਏ, ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ, ਐਨਜ਼ਾਈਮ, ਡੀ ਐਨ ਟੀ ਪੀ, ਅਤੇ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ ਥੋੜਾ ਜਿਹਾ ਡੀ ਐਨ ਏ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਭਟਕਣਾ ਪੈਦਾ ਹੋਵੇਗੀ, ਇਸ ਲਈ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਸਹੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਅਸੰਭਵ ਹੈ. ਇਸ ਲਈ, ਆਰ ਐਨ ਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ. ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਵੱਖੋ ਵੱਖਰੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ ਮੰਨਦੇ ਹੋਏ, ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੁੱਲ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇੱਕੋ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਵੱਖੋ ਵੱਖਰੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੇ ਬਾਅਦ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦੀ ਕਿਉਂਕਿ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਨੂੰ ਸੰਦਰਭ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ.

ਇਹ ਮੁੱਖ ਤੌਰ ਤੇ ਜੀਨਾਂ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਹੈ, ਅਤੇ ਲੰਮੇ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀਕਰਨ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਜੀਨਾਂ ਲਈ ਸੰਭਵ ਨਹੀਂ ਹੈ. ਪਹਿਲਾਂ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪੀਸੀਆਰ ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ. ਦੂਜਾ, ਜੀਸੀ ਅਮੀਰ ਖੇਤਰ ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਜੀਨਾਂ ਦਾ ਸੈਕੰਡਰੀ structureਾਂਚਾ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਦੋਵਾਂ ਨੂੰ ਸੀਮਤ ਕਰਦਾ ਹੈ. ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਅਤੇ ਵਿਸਤਾਰ ਕਾਰਜਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੀ ਗਾਰੰਟੀ ਦੇਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ. ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ, ਕੋਈ ਵੀ ਘੱਟ ਕਾਪੀ ਜੀਨਾਂ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲੰਬੇ ਟੁਕੜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਗਰੰਟੀ ਨਹੀਂ ਦੇ ਸਕਦਾ. ਵਧੇਰੇ ਜੀਸੀ ਵਾਲੇ 5 'ਯੂਟੀਆਰ ਦੇ ਲਈ, ਇਹ ਹੋਰ ਵੀ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ. ਇਸ ਲਈ, ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਨੂੰ ਉਲਟਾਉਣਾ, ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਵਿੱਚ ਕੁਦਰਤੀ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਲੱਭਣਾ, ਖੰਡਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਉਣਾ ਅਤੇ ਫਿਰ ਪਾਬੰਦੀ ਅਤੇ ਪਾਚਨ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕਰਨਾ ਇੱਕ ਵਾਜਬ ਤਰੀਕਾ ਹੈ. ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, 2 ਕੇਬੀ ਤੋਂ ਵੱਡੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਸਿੱਧਾ ਵਧਾਉਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਸਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਹਮੇਸ਼ਾਂ ਅਸੰਭਵ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ: 1. ਸਭ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਆਰਐਨਏ/ਐਮਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦੀ ਗਰੰਟੀ, ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਈਜ਼ੋਲ ਕੱctionਣ ਨੂੰ ਤਰਜੀਹ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ. 2. ਐਮ-ਐਮਐਲਵੀ ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਕਿੱਟ ਸਿੱਧੀ ਵਰਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ. ਐਨੀਲਿੰਗ ਦਾ ਸਮਾਂ ਵਧਾਓ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਸਾਈਕਲ ਨੰਬਰ ਨੂੰ ਸਹੀ ੰਗ ਨਾਲ ਵਧਾਓ. ਵਿਕਲਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਨੇਸਟਡ ਪੀਸੀਆਰ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਾਂ ਆਮ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸਤਾਰ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਉਚਿਤ extendedੰਗ ਨਾਲ ਵਿਸਤਾਰ ਅਤੇ ਵਿਸਤਾਰ ਦੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਵਿੱਚ ਸਹਾਇਤਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿਓ. 3. ਆਦਰਸ਼ ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਲੰਬੀ ਤਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ. 4. ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਕਾਰਜ ਲਈ, ਉੱਚ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ.

TIANGEN ਦੁਆਰਾ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਦੋ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਹਨ: ਕੁਆਂਟ/ਕਿੰਗ ਆਰਟਸੇਜ਼ ਅਤੇ ਟੀਆਈਐਨਸਕ੍ਰਿਪਟ ਐਮ-ਐਮਐਲਵੀ. ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਅੰਤਰ ਖਾਕੇ ਦੀ ਇੰਪੁੱਟ ਮਾਤਰਾ ਹੈ. ਕੁਆਂਟ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਹੈ, ਜੋ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਐਮ-ਐਮਐਲਵੀ ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਹੈ ਜੋ ਮੋਲੋਨੀ ਮੁਰਾਈਨ ਲਿuਕੇਮੀਆ ਵਾਇਰਸ ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਹੈ. ਕੁਆਂਟ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਉੱਚ-ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਾਲਾ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਹੈ ਜੋ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਐਸਚੇਰੀਚਿਆ ਕੋਲੀ ਦੁਆਰਾ ਦੁਬਾਰਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ. ਕੁਆਂਟ ਉੱਚ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ ਉੱਚ ਉਪਜ ਦੇ ਨਾਲ 50 ਐਨਜੀ -2 μg ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ੁਕਵਾਂ ਹੈ. ਆਮ ਐਮਐਮਐਲਵੀ ਜਾਂ ਏਐਮਵੀ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਕੁਆਂਟ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਡੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਇਸਦਾ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸੰਬੰਧ ਹੈ ਅਤੇ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਦੇ ਵਿਗਾੜ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਉੱਚ ਜੀਸੀ ਸਮਗਰੀ ਵਾਲੇ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ, ਉਲਟ ਕਾਰਜਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਧੇਰੇ ਹੁੰਦੀ ਹੈ. ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਵਿੱਚ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ, ਜੋ ਸੀਡੀਐਨਏ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ (<4.5 ਕੇਬੀ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਲਈ ਉਚਿਤ). ਰਵਾਇਤੀ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ, TIANScript MMLV ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ. ਇਹ RTase ਬਹੁਤ ਹੀ ਕਮਜ਼ੋਰ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਸੋਧਿਆ ਹੋਇਆ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਹੈ, ਜੋ ਲੰਬੇ (> 5 kb) ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ੁਕਵਾਂ ਹੈ.

ਵਨ-ਸਟੈਪ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਟਿਬ ਕਵਰ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹੇ ਬਗੈਰ ਇੱਕੋ ਟਿਬ ਵਿੱਚ ਪੂਰਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦਗਾਰ ਹੈ. ਕਿਉਂਕਿ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਸਾਰੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਵਿਸਤਾਰ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਵਧੇਰੇ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਘੱਟੋ ਘੱਟ 0.01 ਪੀਜੀ ਕੁੱਲ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਨਾਲ. ਸਫਲ ਇੱਕ-ਕਦਮ ਆਰਟੀਪੀਸੀਆਰ ਲਈ, ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਆਮ ਤੌਰ ਤੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ. ਦੋ-ਪਗ ਵਿਧੀ, ਅਰਥਾਤ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸਤਾਰ ਦੋ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ. ਸਭ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਤੋਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਸੀਡੀਐਨਏ ਇੱਕ ਜਾਂ ਵਧੇਰੇ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਅਧੀਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ. ਦੋ-ਪੜਾਵੀ ਵਿਧੀ ਓਡੀਗੋ (ਡੀਟੀ) ਜਾਂ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਕਿਨਾਰੇ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰਨ ਲਈ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਨਮੂਨੇ ਤੋਂ ਸਾਰੀ ਐਮਆਰਐਨਏ ਜਾਣਕਾਰੀ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਦੇ ਸਕਦੀ ਹੈ.